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待解决
1.亚细胞定位显示SGIV-19R分布于EPC细胞质内。
2. 共定位分析表明该蛋白部分与内质网（ER）共定位。
EGFP标记的SGIV-19R信号与ER特异性RFP信号部分重叠，在转染后24和48小时的细胞融合通道中出现黄色荧光。然而，在细胞中没有观察到这样线粒体或高尔基体被RFP标记的重叠（数据未显示），SGIV-19R蛋白部分共定位于 EPC细胞中的ER。
3. SGIV-19R基因疫苗在石斑鱼体内的表达
RT-PCR和Western blot分析证实了DNA疫苗pcDNA3.1-19R在接种石斑鱼肌肉组织中表达SGIV-19R，且SGIV-19R的高表达水平与较高的接种剂量相关。
4. 免疫相关基因的转录水平
免疫石斑鱼脾脏、肝脏和肾脏中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、Mx1和免疫球蛋白M（IgM）基因的转录水平显著上调。
5. DNA疫苗的保护效果评价
为了检验疫苗的保护作用，石斑鱼在15dpv时腹腔注射SGIV，在接种后21天内监测死亡率。如图5所示，死亡首次记录在6 dpi的 pcDNA3.1（C）组，随后是8 dpipcDNA3.1-19R（L）组，接着是10dpi pcDNA3.1-19R（H）组。在45μg pcDNA3.1-19R的DNA剂量下，49.9%的鱼的相对存活率显著提高，而在90μg pcDNA3.1-19R的DNA剂量下，75.0%的鱼的相对存活率显著降低。这些数据表明适当剂量的pcDNA3.1-19R可作为一种有效的疫苗免疫石斑鱼抗SGIV感染的研究。
6. SGIV病毒载量的检测
qPCR法进一步检测各组死亡和存活石斑鱼脾脏SGIV病毒载量。如表3所示，存活石斑鱼的病毒载量范围较低，从1.32×101到1.21×102 copies/μg病毒DNA，当使用更多的DNA疫苗时病毒载量较少。相反，SGIV-19R表达组和载体表达组死亡石斑鱼的脾组织中病毒DNA含量大于5.33×106 copies/μg。死亡石斑鱼表现出典型的SGIV感染出血症状，而存活的石斑鱼没有表现出这些症状。SGIV攻击后存活石斑鱼脾脏病毒载量低。
总之，我们的研究结果表明，编码SGIV-19R蛋白的DNA疫苗pcDNA3.1-19R能有效地保护石斑鱼应对SGIV挑战。此外，表达pcDNA3.1-19R基因可以增强石斑鱼天然免疫反应和适应性免疫反应，这是对抗SGIV感染必不可少的。这些结果提示pcDNA3.1-19R可能是控制SGIV病的一种候选疫苗。
