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在马来西亚西部的一个杂交石斑鱼（褐点石斑鱼×龙胆石斑鱼）孵化场进行横断面取样，以检测2016年9月30日至2017年3月29日期间常规杂交石斑鱼鱼苗生产期间是否存在VNN。孵化场每年生产大约两到三个鱼批次。在每个采样期间，评估与NNV感染和VNN疾病相关的危险因素，如鱼龄、水系统、人工饲料、活饲料、生命期（从鱼苗到成鱼）和水质参数。所有与VNN相关的临床症状均在取样过程中观察和记录。在整个研究期间，共对220个杂交石斑鱼鱼苗（一个鱼池中第0天的3000个仔鱼；17个鱼池中第10天的85个仔鱼；两个鱼池中第20天的40个仔鱼；第30、40、60和90天的20个仔鱼；以及第180天的14个仔鱼）进行了新的取样和相应的汇集（表1）。
为了确认VNN引起的病毒的水平传播，每天从饲养杂交石斑鱼的池塘和水池中采集500 mL水样，一式两份。为了评估与VNN相关的危险因素，在采样期间，在混合石斑鱼饲养池和罐中的深度约1米处测量水质参数。测量的水质参数包括温度、溶解氧含量、pH值、盐度、氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐浓度，所有这些都是使用手持YSI™仪表在现场测量。记录的数据被用来确定VNN或其相关病毒的发生与杂交石斑鱼不同生活阶段孵化场水质的可能关联。在第10天和第60天采集500mL活饲料样本，包括桡足类和轮虫，在第60天、第90天和第180天同样采集人工饲料样本，以确定VNN引起的病毒在杂交石斑鱼之间可能的水平传播。在采样期间采集的所有样品在进一步分析前均储存在-20°C下。
对VNN相关序列进行逆转录RT-PCR和巢式PCR扩增（表2）。利用MEGA方法，从已知的所有Betanodavirus种的外壳蛋白基因中推断出包含VNN致病因子的系统发育树。计算Pearson相关系数，以确定杂交石斑鱼样本中VNN的存在与其相关危险因素之间的相关性强度。
主要研究结果如下：
孵化场管理
在整个研究期间，没有在孵化场实施适当的饲养做法、良好的卫生或检疫（表3）。设施不同部分之间的生物安全维护也被忽视。孵化场从附近的河口直接向养殖容器抽水，没有臭氧氧化系统或适当的过滤器来过滤进出水。在第0天获得的预孵化幼虫在海水中的圆形产卵池中培养（温度=32.3℃，盐度=25.71 ppt）。然后，在第2天，用绿水将幼虫转移到土塘（温度=32.3℃，盐度=25.71 ppt），并饲养至第25天。在此期间，根据轮虫的数量，每天给幼虫喂6-8次室内生产的轮虫和桡足类。为防止幼虫暴露在阳光直射下，用黑色遮光网覆盖和包围土塘。当幼虫达到26天龄时，将其转移到6个圆形聚氯乙烯罐（水温=32℃，盐度=26 ppt）中并在其中进行分割，然后饲养至180天龄（生长/成虫期）。28天时，用人工饲料喂养仔鱼，不给它们喂食杂鱼。
水质参数
从第0天到第180天，每天取样测得的水质参数在孵化场设置的正常范围内显示出值（表4）。从第30天到第60天，水温低于研究期间的其他时间（29°C）。同样，在第30天到第40天（18-19 ppt）之间，观察到海水盐度较低。培养30～180天（5.52～5.74mg/L）的溶解氧明显高于0～20天（4.42～4.52mg/L）。pH值在180天达到最低，30天达到最高，但不低于7。
VNN检测
146个集合样本和个体样本中，包括杂交石斑鱼、水和人工饲料样本在内，共有113个样本在VNN相关病毒检测中显示阳性结果。感染的临床症状包括皮肤变黑、脊椎变形、腹胀、皮肤损伤和鱼鳍糜烂。VNN存在于杂交石斑鱼的整个生命阶段，第一次检测发生在第10天（表5）。
VNN相关危险因素分析
与VNN相关的危险因素包括水温、溶解氧含量、盐度、氨含量、鱼体大小（成年鱼比幼鱼更危险）和生命期（年龄）（表6）。在水样中检测到VNN相关病毒证明了该病的水平传播。
本研究所发现的所有核苷酸序列彼此具有88%到100%的高核苷酸同源性，分别是NNV/SJNNV (RGNNV/SJNNV) 430.2004（GenBank登录号JN189932.1）（n=26）。系统发育分析表明，每个VNN病毒阳性样本中均存在相似种，且随样本类型和生命期的不同而不同（图2）。
本研究首次证实了马来西亚和南洋杂交石斑鱼鱼类神经坏死病毒重组株（RGNNV/SJNNV）的存在。然而，这种病毒的传播方式和危险因素之间的关系需要进一步研究，以了解重组株的进化和潜在的新寄主物种。
